Bài 6.  Sắc kí trao đổi ion các aminoaxit

Trao dổi ion là một phương pháp phân tích và điều chế quan trọng cho phép phân tách các chất mang điện. Sự tương tác giữa các nhóm ion của chất với các gốc gắn trên nhựa là cơ sở của phương pháp này. Ở bài này, phải phân tách một hỗn hợp các aminoaxit, tiếp theo thử định tính từng loại aminoaxit được tách ra từ cột bằng phản ứng màu đặc trưng. Do thí sinh  phải sắp hàng đo phổ nên chúng tôi đề nghị bạn hãy bắt đầu với bài thực hành số 1.

Cho một hỗn hợp gồm ba aminoaxit: histidin, cystein và arginin (xem cấu trúc trên). Polistyren liên kết chéo bởi gốc sunfat là nhựa trao đổi cation  (xem sơ đồ dưới đây). Trước khi thí nghiệm cột sắc kí trao đổi ion đã được nhồi sẵn và cân bằng với Dung dịch rửa giải 1 (pH  4,9).

Qui trình tiến hành

Tiến hành sắc kí. Bước 1.

Đưa dung dịch các aminoaxit lên cột sắc kí.

Đầu tiên, mở khóa để cho dung môi trong cột chảy xuống bình tam giác (Erlenmeyer) có ghi "Chất thải" sao cho dung môi vẫn còn nằm trên bề mặt chất nhồi và tránh không để cho nó bị khô. Đóng khóa lại và thận trọng dùng một syranh cho dung dịch phân tách lên cột. Mở khóa và để cho dung dịch này ngấm vào chất nhồi (xả dung môi vào bình "Chất thải"). Đóng khóa cột và cẩn thận mở (nhả) từ từ kẹp ống để cho chảy vào khoảng 1 mL Dung dịch rửa giải 1 (ứng với ~ 1 cm của chất lỏng trên cột). Dùng hai tay nối chặt đầu nối có nhám trong (nhám cái) ở đầu cột vào đầu nối có nhám ngoài (nhám đực) ở đầu ống dẫn dung dịch rửa giải 1 (xem kỹ việc nối chặt đầu thủy tinh với cột). Bỏ bình "Chất thải" ra và thay vào các ống nghiệm trên giá. Mở từ từ kẹp ống và mở khóa để dung dịch rửa giải chảy xuống qua cột. Bắt đầu quá trình rửa giải (luôn mở khóa cột khi bắt đầu rửa giải và đóng khóa lại khi ngừng rửa).

Thu gom các phân đoạn vào ống nghiệm, lấy khoảng 2,5 mL (xem mũi tên ở sơ đồ). Nếu thấy cần thì dùng bút dạ đánh dấu. Sau khi gom được từ 4 đến 8 ống, ngừng rửa giải và sau đó phân tích định tính các mẫu (phân đoạn) thu được.

Định tính các mẫu  thu được

Định tính các aminoaxit dựa trên phản ứng của nhóm α-amino với natri 2,4,6-trinitrobenzen sunfonat (TNBS):

Định tính được thực hiện trong các lỗ của tấm nhựa polistyren, mỗi lỗ tương ứng với mỗi ống nghiệm xác định. Trước khi thử, đầu tiên hãy trộn 1 mL dung dịch TNBS với 10 mL dung dịch đệm cacbonat và sau đó cho 0,1 ml hỗn hợp thu được vào một nửa các lỗ trên tấm nhựa (từ A1 đến H5). Tiếp theo, cho 0,1 mL của phân đoạn cần phân tích vào lỗ. Bắt đầu thử với A1, và tiếp tục với B1, C1, v.v. (di chuyển từ trên xuống và từ trái sang phải). Nếu aminoaxit có mặt trong phân đoạn phân tích thì màu vàng đậm sẽ xuất hiện trong lỗ trong khoảng 3 phút. Lấy màu trong lỗ đầu làm chuẩn để đối chiếu. Để đánh giá đúng màu, bạn nên để tấm nhựa lên tờ giấy trắng.

Lưu ý: Dùng pipet máy để lấy tất cả các chất lỏng mà có thể tích 0,1 mL. Bạn nên dùng một đầu hút nhựa cho tất cả các phân đoạn có một chất (đỉnh).

6.1a  Đánh dấu mô tả sơ lược cường độ màu (định tính) trên tấm nhựa (có lỗ ) vào Phiếu Trả lời. Dùng các kí hiệu sau: (-)- không màu, 1-màu yếu, 2- màu vừa phải và 3- màu mạnh. Tiếp tục đánh dấu sự mô tả này trong quá trình sắc kí.

Tiếp tục rửa giải để thu các phân đoạn và phân tích chúng cho đến khi bạn nhận được ít nhất 2 lỗ có màu như ở lỗ A1, điều này chỉ ra rằng aminoaxit thứ nhất đã hoàn toàn ra hết khỏi cột (kết thúc đỉnh (peak) thứ nhất).

Tiến hành sắc kí. Bước 2.

Ngay sau khi kết thúc thu gom đỉnh (peak) thứ nhất, bạn phải thay Dung dịch rửa giải thứ 2. Để làm điều này, hãy đóng khóa cột, đóng (vặn chặt) kẹp ống dẫn (Quan trọng !), tháo ống dẫn đang nối với chai đựng Dung dịch rửa giải thứ 1 và nối nó với chai đựng Dung dịch rửa giải thứ 2. Giữ chặt đầu nối nhám ở đầu cột.

6.1b. Khi các Dung dịch rửa giải được thay đổi, hãy đánh dấu bằng cách vẽ các đường thẳng nằm giữa các lỗ tương ứng ở tấm nhựa.

Tiếp tục rửa giải, thu các phân đoạn và phân tích định tính chúng như đã miêu tả ở trên.

Tiến hành sắc kí. Bước 3.

Ngay sau khi kết thúc thu gom đỉnh (peak) thứ 2, bạn phải thay Dung dịch rửa giải thứ 3 như đã miêu tả ở bước 2. Tiếp tục sắc kí cho đến khi aminoaxit thứ 3 hoàn toàn ra khỏi cột.

Dừng quá trình sắc kí bằng cách đóng khóa cột và vặn chặt kẹp ống.

Dựa vào kết quả phân tích định tính, hãy chọn những phân đoạn có chứa các aminoaxit.

6.1.c  Hãy điền vào Phiếu Trả lời nhãn ghi (số thứ tự) của các lỗ ứng với các phân đoạn đã chọn ở trên.

6.2 Gộp lại các phân đoạn có cùng một đỉnh và dùng ống đong để đo thể tích của từng phân đoạn gộp. Báo cáo thể tích của các phân đoạn đã gộp ngoại trừ lượng đã dùng cho phân tích định tính. Ghi các kết quả  thu được vào Phiếu Trả lời.

Rót các phân đoạn gộp vào lọ thủy tinh nâu có ghi nhãn "Peak 1", "Peak 2" "Peak 3". Chuẩn bị các mẫu để phân tích định lượng trên máy quang phổ như mô tả dưới đây.

Khi kết thúc bài thi thực hành, hãy nút các lọ và để chúng trên bàn. Các phân đoạn gom sau đó sẽ được nhân viên phòng thí nghiệm phân tích kiểm tra lại.

Phân tích quang phổ

Đối với mỗi mẫu, bạn cần phải đưa 2 cuvet cho người đo mẫu. Chuẩn bị mẫu như sau.

Quan trọng! Khi bảo quản, luôn để cuvet trong hộp! Tất cả các cuvet có 2 mặt hông và 2 mặt trơn nằm thẳng đứng dùng để đo. Khi dùng cuvet, không được chạm vào mặt dùng để đo, nếu không bạn sẽ thu được giá trị mật độ quang sai.

Phép thử số 1(đỉnh 1). Nồng độ cystein được xác định bằng phản ứng Ellman:

Ống nghiệm A1 (ống đối chiếu). Cho 0,1 mL Dung dịch rửa giải 1 lấy từ ống nhựa nhỏ vào một ống nghiệm và cho thêm vào 2.9 mL tác nhân Ellmann.

Ống nghiệm B1 (ống mẫu phân tích). Cho 0,1 ml dung dịch phân tích vào một ống nghiệm và cho thêm vào 2.9 mL tác nhân Ellmann.

Trộn đều các ống nghiệm và chuyển mỗi hỗn hợp sang các cuvet tương ứng có ghi A1 (cho mẫu đối chiếu) và B1 (cho mẫu phân tích).

Mẫu thử số 2 (đỉnh 2). Xác định nồng độ histidin dựa trên khả năng của gốc imidazol phản ứng với các hợp chất diazo (phản ứng Pauli).

Ống nghiệm A2 (ống đối chiếu). Cho 2,8 mL dung dịch đệm Tris-HCl vào một ống nghiệm, cho thêm vào 0,1 mL Dung dịch rửa giải 2 lấy từ ống nhựa nhỏ và 0,1 mL tác nhân Pauli.

Ống nghiệm B2 (ống mẫu phân tích). Cho 2,8 mL dung dịch đệm Tris-HCl vào một ống nghiệm, tiếp theo cho thêm 0,1 mL dung dịch cần phân tích và 0,1 mL tác nhân Pauli.

Trộn đều các ống nghiệm và chuyển mỗi hỗn hợp sang các cuvet tương ứng có ghi A2 (cho mẫu đối chiếu) và B2 (cho mẫu phân tích).

Mẫu thử số 3 (đỉnh 3). Xác định nồng độ của arginin dựa trên khả năng của gốc guanidin phản ứng với một số phenol trong điều kiện kiềm và chất oxi hóa (phản ứng Sakaguchi).

Ống nghiệm A3 (ống đối chiếu). Cho 0,1 mL Dung dịch rửa giải 3 vào một ống nghiệm, tiếp theo cho thêm 1,5 mL dung dịch NaOH 10%, 1 mL dung dịch 8-hydroxiquinolin và 0,5 mL dung dịch natri hypobromua.

Ống nghiệm B3 (ống mẫu phân tích). Cho 0,1 mL dung dịch phân tích vào một ống nghiệm, tiếp theo cho thêm 1,5 mL dung dịch NaOH 10%, 1 mL dung dịch 8-hydroxiquinolin và 0,5 mL dung dịch natri hypobromua.

Lắc mạnh các ống nghiệm trong 2 phút (Quan trọng!) và quan sát sự tạo thành màu vàng cam. Cho 0,2 mL dung dịch urê 8 M vào mỗi ống, trộn kỹ và lấy khoảng 3 mL của mỗi hỗn hợp cho vào các cuvet tương ứng ghi A3 (cho mẫu đối chiếu) và B3 (cho mẫu phân tích).

Tất cả các hỗn hợp cần phải phân tích bằng quang phổ không được sớm hơn 10 phút và không được muộn hơn 2 giờ sau khi chuẩn bị xong mẫu. Đưa 6 cuvet cho nhân viên đo mẫu. Trong trường hợp phải sắp hàng chờ, hãy đề nghị nhân viên đo mẫu ghi mã số thí sinh của bạn lên bảng đánh dấu sắp hàng. Bạn sẽ được gọi khi đến lượt mình. Trong thời gian này bạn có thể bắt đầu làm bài thự hành số 2.

Trong trường hợp các mẫu của bạn không kịp khảo sát trong khoảng thời gian phù hợp đã nêu trên (hoàn toàn không thể xẩy ra), bạn phải chuẩn bị lại mẫu mới.

Nhận bản in phổ đồ các mẫu của bạn và kiểm tra lại. Kí nhận vào bản phổ đồ và xin chữ kí của nhân viên đo mẫu.

6.3  Hãy xác định độ hấp phụ ở các bước sóng tương ứng và tính hàm lượng (theo mg) của mỗi aminoaxit trong hỗn hợp của bạn. Độ dài quang là 1,0 cm. Điền vào Phiếu Trả lời, nhớ rằng 1 mol của mỗi aminoaxit cho 1 mol sản phẩm tương ứmg.

Dữ liệu đối chiếu:

6.4  Vẽ 3 cấu trúc cộng hưởng của các gốc phân tử tham gia vào sự tạo thành hỗn hợp màu trong phản ứng Ellmann