Bài 9. Thủy phân N-axetyl-alanin bằng enzim;

ví dụ của quá trình hóa học thân thiện với môi trường

Lí thuyết:

Phản ứng sinh học được xúc tác bởi enzim. Nhiều enzim biểu lộ khả năng chọn lọc cao và thường có thể xúc tác chọn lọc cho một đồng phân đối quang của hỗn hợp triệt quang. Trong hóa học hiện đại enzim được dùng cho nhiều quá trình tiến hành trong ống nghiệm, đặc biệt trong sự tổng hợp các đồng phân quang học tinh khiết. Thí nghiệm này xem xét sự thủy phân N-axetyl-alanin với enzim axylaza I (acylase I).

Sơ đồ phản ứng được nêu dưới đây:

Hỗn hợp raxemic N-axetyl-alanin                        N-axetyl-alanin          alanin

Có thể theo dõi diễn tiến phản ứng dựa trên sự tạo thành alanin nhờ phản ứng với ninhidrin như dưới đây.

ninhidrin                            indan-1,2,3-trion

    alanin               anion màu tím lmax = 592 nm

Hóa chất cần thiết:                                    Mã an toàn:

N-axetyl-alanin raxemic (265 mg)              R - S -

Acylase I (10 mg)                                       R - S -

Liti hidroxit (85 mg)                                   R 23-34 S 45-26-27-36/37/39

Dung dịch ninhidrin (Sigma N1632) (2 mL) R 11-20/21/22-34 S 16-26-27-36/37/39

Dimetyl sunfoxit (khỏang 70 mL)              R 36/37/38 S 26-36-23

Đệm liti axetat pH 5,2                      R 20/21/22-63 S 22-36

Tiến hành:

Hòa tan 262 mg (2,0 mmol) hỗn hợp raxemic N-axetyl-alanin trong 10 mL nước. Sau đó thêm từ từ và khuấy nhẹ dung dịch chứa 84 mg (2,0 mmol) liti hidroxit monohidrat trong 4 mL nước. Theo dõi pH bằng giấy pH đến khi đạt pH = 7. Thêm dung dịch  acylase I (10 mg) trong nước đồng thời khuấy mạnh trong 2 phút. [ Điều chế dung dịch enzim này bằng cách thêm enzim vào 5 mL nước và lọc bằng lọc thủy tinh nhỏ được phủ với diatomit]. Kế tiếp, thêm nước vào để thể tích tổng cộng đạt chính xác 20,0 mL. Hỗn hợp phản ứng được giữ tại nhiệt độ 37°C (chưng cách thủy) trong 60 phút. Dùng ống tiêm hoặc pipet nhỏ lấy chính xác 0,25 mL dung dịch enzim cho vào ống nghiệm rồi thêm 1,25 mL ninhidrin (Sigma N 1632), (1.25 mL). Đun nóng hỗn hợp này trong nước sôi khoảng 20 phút, lúc ấy sẽ có màu tím thẫm. Sau khi để nguội, cho hỗn hợp này vào dung dịch đệm có chứa dung dịch liti axetat 4 M (pH = 5,2) và dimetyl sulfoxit theo tỉ lệ 1 : 3 trong ống đong 250 mL. Điều chỉnh thể tích đến 250 mL. Sau đó đo sự hấp thụ bằng phổ kế tại l = 592 nm. Dùng ninhidrin trong cùng dung dịch đệm (liti axetat trong dimetyl sulfoxit) để tham chiếu. epurple complex = 13350 L mol–1 cm–1.

Ghi lại các số liệu sau:

1. Nồng độ ban đầu của hỗn hợp raxemic N-axetyl-alanin.

2. Hấp thụ tại l = 592 nm.

3. Tính số mmol alanin tạo thành trong phản ứng enzim. Dùng định luật Lambert-Beer.

4. Tính phần trăm chuyển hóa.

Câu hỏi:

9-1    Alanin tạo thành có quang hoạt không?

9-2    N-axetyl-alanin vẫn không quang hoạt, quang hoạt hơn hay tinh khiết về mặt quang học khi sự chuyển hóa nhỏ hơn 50%?

9-3    Cũng câu hỏi như trên khi sự chuyển hóa đạt chính xác 50%?

9-4    Có thể chuyển hóa trên 50% hay không?

Ghi chú quan trọng:

Nếu thời gian cho phép, có thể dừng phản ứng sau 10, 25, 40 và 60 phút để xác định nồng độ alanin trong mỗi trường hợp. Từ đó, vẽ đồ thị biểu diễn nồng độ alanin theo thời gian, và ước lượng thời gian phản ứng tối ưu.